一、凝膠過(guò)濾層析

    凝膠過(guò)濾分子篩層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對(duì)混合物中各組分按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)。具有分子篩作用的物質(zhì)很多，如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。

    凝膠過(guò)濾層析的應(yīng)用

1、可分離相對(duì)分子量從幾百到幾十萬(wàn)的物質(zhì)具有3000個(gè)理論塔板的凝膠過(guò)濾可將分子量相差2倍的蛋白質(zhì)*分開(kāi),6000個(gè)理論塔板的可將分子量相差1.5倍的蛋白質(zhì)*分開(kāi);建議柱高在80-120cm,直徑=H/30

2.脫鹽

   凝膠過(guò)濾層析的特點(diǎn)：

1、層析柱規(guī)模很大，實(shí)驗(yàn)室1.0-2.5×30-100cm，工藝10－20×200cm，從而設(shè)備成本很高；

2、上樣體積少，必須少于柱床體積的3％才能達(dá)到較好的分離效果，如果大體積樣品必須濃縮，從而造成樣品的損失和增大工藝的復(fù)雜性；

3、工藝時(shí)間（生產(chǎn)周期）長(zhǎng)，甚至24小時(shí)或以上；

4、分辨率低；

5、不需摸索純化條件，按照分子量區(qū)帶分離。因此，往往用分子篩分離時(shí)只適用于純化的后一步，或離子交換上樣前的脫鹽。

二、離子交換層析

    離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來(lái)分離離子型化合物的一種方法。

1、緩沖液與pH：選擇適當(dāng)?shù)木彌_體系，起始濃度要盡可能低些(0.01-0.05M)緩沖液PH值：陽(yáng)離子低于pI一個(gè)pH單位以上陰離子通常高于pI一個(gè)pH單位以上。蛋白質(zhì)在不同pH下保留行為差別較大，所以許對(duì)緩沖體系和操作pH進(jìn)行摸索，以得到佳層析條件。

2、離子強(qiáng)度;洗脫時(shí)多采用離子濃度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.在不同鹽濃度（離子強(qiáng)度）及其不同變化率（梯度）條件下保留行為不同，需對(duì)該條件進(jìn)行摸索。一般的，隨離子強(qiáng)度增加，蛋白質(zhì)保留值減小。

三、疏水層析

原理：基于生物分子表面疏水性不同而達(dá)到分離的技術(shù)。疏水作用來(lái)自于分子的水化結(jié)構(gòu)，高濃度鹽溶液破壞生物分子的水化結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于分子外表面，從而可與疏水介質(zhì)結(jié)合。不同離子的疏水性–Anions:SO42->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN–Cations:Mg2+>Li+>Na+>K+>NH4+。

    蛋白質(zhì)以高濃度鹽溶液結(jié)合與疏水層析柱上，以低濃度鹽溶液洗脫。生物分子表面大都有或強(qiáng)或弱的疏水區(qū)域，在不同環(huán)境下，與各種疏水介質(zhì)產(chǎn)生不同強(qiáng)弱的結(jié)合。高離子強(qiáng)度可加強(qiáng)疏水性。跟離子交換相反，高鹽吸附，低鹽洗脫；洗脫樣品又可直接或稍加稀釋后加上其他層析柱，作為連接層析步驟的橋梁，取代鹽析沉淀技術(shù)。配體種類繁多，很難預(yù)測(cè)哪一種、哪一個(gè)條件適合，可用疏水層析試盒選擇介質(zhì)

四、親和層析

    親和層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離目的的一類特殊層析技術(shù)。親和層析純化過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速，且分離效率高。

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